四、流式細(xì)胞儀免疫分型實(shí)驗(yàn)

    1.樣本采集、運(yùn)輸、保存和操作
    （1）樣本類(lèi)型：適用于多種臨床標(biāo)本，如外周血、骨髓穿刺液、骨髓活檢物、淋巴樣組織活檢物、漿液、腦脊液、皮膚、黏膜（內(nèi)窺鏡活檢物）、細(xì)針穿刺物等等。
    （2）抗凝劑的選擇：外周血標(biāo)本可采用EDTA、ACD或肝素抗凝。如果用同一份血標(biāo)本做白細(xì)胞計(jì)數(shù)和流式分析，則應(yīng)用EDTA抗凝。骨髓穿刺可用肝素。其他體液用EDTA、ACD或肝素均可，但保存的樣本活性可能會(huì)降低，EDTA的優(yōu)點(diǎn)是成熟髓性細(xì)胞貼壁造成的損失及血小板聚集較小，但細(xì)胞散射光特征丟失較肝素標(biāo)本快；由于相對(duì)大量的ACD會(huì)通過(guò)改變pH而影響骨髓細(xì)胞活性問(wèn)題，通常不推薦用ACD做骨髓穿刺抗凝劑。
    （3）樣本的保存：樣本的完整性和細(xì)胞活性與抗凝劑的選擇、運(yùn)輸、保存和溫度息息相關(guān)。
    ①理想狀態(tài)下，樣本應(yīng)在采集后立刻進(jìn)行處理和染色。
    ②短期保存（1小時(shí)或更短）應(yīng)在室溫（18-22℃）。
    ③長(zhǎng)時(shí)間保存血或骨髓標(biāo)本室溫即可，有些樣本可能4℃為佳。
    ④標(biāo)本保存的時(shí)間上限取決于標(biāo)本類(lèi)型及其保存條件。
    ⑤肝素抗凝的血和骨髓通常可保存至48-72小時(shí)；
    ⑥EDTA抗凝的血和骨髓可保存至12－24小時(shí)。
    ⑦ACD抗凝的血和骨髓可保存至72小時(shí)，但
    ⑧對(duì)于只做胞內(nèi)染色的樣本，可固定細(xì)胞以長(zhǎng)期保存。但？quot;固定－染色“的方法取決于要分析的抗原特性和染色方式，采用之前一定要進(jìn)行新鮮標(biāo)本的對(duì)照和驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。

    2.樣本制備
    （1）單細(xì)胞懸液的制備
    ①血和骨髓：天然單細(xì)胞懸液。當(dāng)有血凝塊時(shí)，應(yīng)用50um尼龍網(wǎng)過(guò)濾，同時(shí)進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)和血涂片以判斷靶細(xì)胞群體是否仍然存在。
    ②組織塊：機(jī)械分離和酶分離兩種方法。分離不僅是要獲得最大產(chǎn)量的單細(xì)胞懸液，還要盡量保證細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整性和抗原性。大多數(shù)淋巴樣組織可用輕柔的機(jī)械方法快速分離，并保持收獲細(xì)胞的相對(duì)完整。某些組織由于細(xì)胞間連接緊密，需在機(jī)械分離的基礎(chǔ)上用蛋白水解酶如胰蛋白酶、胃蛋白酶。骨髓標(biāo)本亦可能因骨細(xì)胞成分污染而需要酶消化。但使用酶法一定要確認(rèn)酶的使用沒(méi)有改變、減弱靶抗原的表達(dá)，細(xì)胞活性沒(méi)有顯著降低。
    （2）分離靶細(xì)胞群體
    樣本的任何處理方式都可能導(dǎo)致靶細(xì)胞群體的丟失。所以應(yīng)盡可能使用最接近原始標(biāo)本狀態(tài)的處理過(guò)程。去除紅細(xì)胞是流式分析要求的至少步驟。兩種方法：
    ① 紅細(xì)胞裂解：較佳。操作簡(jiǎn)單、快、并最可能保持原始標(biāo)本的白細(xì)胞分布。溶血?jiǎng)┑倪x擇應(yīng)基于其選擇性去除成熟紅細(xì)胞而最小程度的影響其他細(xì)胞的特點(diǎn)。最好在染色后溶血。若在染色前溶血，需確認(rèn)：抗原性不被溶血過(guò)程改變； 溶血?jiǎng)┍粡氐紫慈?，?xì)胞和抗體結(jié)合的動(dòng)力反應(yīng)未受影響；所用溶血?jiǎng)┎缓潭▌?，否則會(huì)影響細(xì)胞活性及表面標(biāo)記結(jié)果 。
    ② 度梯度離心：白血病細(xì)胞回收較好并可能得到富集，同時(shí)去除死細(xì)胞。但費(fèi)時(shí)，白血病細(xì)胞的相對(duì)頻率較難分析，某些重要細(xì)胞群體可能選擇性丟失。根據(jù)密度梯度原理，若白血病細(xì)胞沒(méi)有與淋巴細(xì)胞相似的浮力密度即可能丟失。所以用此方法時(shí)應(yīng)檢查各層細(xì)胞特性以防止靶細(xì)胞的丟失。
    （3）估細(xì)胞懸液
    ①樣本外觀：有嚴(yán)重溶血和血凝塊的標(biāo)本可能會(huì)有白細(xì)胞的損壞以及細(xì)胞亞群的丟失或改變，應(yīng)棄用。
    ②細(xì)胞丟失和分布：確認(rèn)細(xì)胞形態(tài)和原始標(biāo)本相似。密度梯度離心之后更應(yīng)檢查細(xì)胞分布。可做血涂片判斷。
    ③細(xì)胞計(jì)數(shù)和濃度調(diào)整：廠(chǎng)家推薦的抗體濃度通常是假定靶細(xì)胞數(shù)量在正常范圍內(nèi) （500,000-1,000,000／testAb）。白細(xì)胞數(shù)量上的顯著變化會(huì)帶來(lái)染色模式的變化。而白血病標(biāo)本常常有異常的白細(xì)胞數(shù)量，骨髓標(biāo)本也可能被外周血稀釋?zhuān)@些標(biāo)本的細(xì)胞性可能有極大的變異。因此有些標(biāo)本沒(méi)有足夠的細(xì)胞做流式分析，有些則由于細(xì)胞量大，正常濃度下的抗體相對(duì)不足，不能飽和所有的結(jié)合位點(diǎn)，導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果。所以染色前的細(xì)胞計(jì)數(shù)非常必要。推薦方法： WBC<1000/uL: 用200uL全血并調(diào)整相應(yīng)溶血?jiǎng)┯昧浚?WBC:1000-10000/uL, 用100uL全血并用溶血?jiǎng)?biāo)準(zhǔn)量； WBC:10000-20000/uL, 用50uL全血并調(diào)整相應(yīng)溶血?jiǎng)┯昧浚?WBC>20000/uL，用稀釋至（2）（3）范圍內(nèi)。骨髓標(biāo)本常常要在PBS 1:10稀釋后計(jì)數(shù)。應(yīng)該指出，由于不同的標(biāo)本中不同系列的細(xì)胞比例不同，調(diào)整細(xì)胞總數(shù)不一定合適每一個(gè)系列特異的抗體。實(shí)驗(yàn)室若選擇不同于廠(chǎng)家推薦的方法（如自己稀釋抗體），抗體一定需要進(jìn)行測(cè)試以得到抗體和細(xì)胞的最佳比率。
    ④細(xì)胞活性：死細(xì)胞對(duì)許多抗體有非特異性染色，有些抗原同時(shí)存在于胞膜和胞漿，這就使樣本的細(xì)胞活性檢測(cè)變得重要，尤其7-AAD或EMA（ethidium monoacide）。活細(xì)胞將拒染這些染料。此方法的優(yōu)勢(shì)是細(xì)胞表面標(biāo)志和活性分析可同時(shí)進(jìn)行，通過(guò)設(shè)門(mén)即可得到活細(xì)胞的染色特性。尤其適用于高度壞死的樣本。樣本染色后需固定。應(yīng)在加固定劑之前洗去多余的7AAD，以保證區(qū)分的是固定前細(xì)胞的死活狀態(tài)。但隨著時(shí)間延長(zhǎng)，7AAD會(huì)在固定的細(xì)胞群體重新分配，死活細(xì)胞的區(qū)分變難。對(duì)于染色后常規(guī)固定并在固定后12小時(shí)以上分析的標(biāo)本，最好用EMA。EMA與死細(xì)胞DNA穩(wěn)定的共價(jià)結(jié)合保證了長(zhǎng)時(shí)間固定后仍能很好地區(qū)分固定前的死活狀態(tài)。二是手工檢測(cè)：使用Trypan blue 或其他細(xì)胞活性染料。
    （4）細(xì)胞染色
    ①細(xì)胞表面染色：大多數(shù)可幫助白血病免疫分型的抗原都在細(xì)胞膜上。但由于許多抗原也同時(shí)存在細(xì)胞內(nèi)，所以在細(xì)胞表面抗原檢測(cè)時(shí)應(yīng)特別注意保持細(xì)胞膜的完整以保證檢測(cè)的特異性。例如免疫球蛋白重鏈在細(xì)胞內(nèi)和表面的存在有著不同的意義，檢測(cè)表面標(biāo)記必須是未固定的活細(xì)胞。
    ②細(xì)胞內(nèi)染色：有些胞內(nèi)特異性抗原的檢測(cè)對(duì)白血病的免疫分型尤為重要，如TdT, MPO, cCD3, cCD22, 以及胞漿內(nèi)Ig的表達(dá)。胞內(nèi)染色的關(guān)鍵是使細(xì)胞膜通透，把抗體導(dǎo)入胞漿而不影響細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整性。要保證固定和透膜的步驟不影響有關(guān)標(biāo)記的抗原性以及和抗體的結(jié)合。
    ③胞膜和胞內(nèi)的同時(shí)染色：通常，先胞膜染色，固定，膜通透和胞內(nèi)染色，最后是DNA染色。固定劑和通透劑都可能對(duì)細(xì)胞和參數(shù)有不同的多重影響，應(yīng)根據(jù)情況選擇。每一步染色對(duì)熒光素的選擇和抗體的選擇都很重要。如，用于表面標(biāo)記的熒光素應(yīng)不被隨后的固定和通透步驟所影響，而對(duì)于胞內(nèi)染色，所用的熒光素應(yīng)足夠小能穿透到胞膜內(nèi)。

    3. 抗體組合的確定：
    選擇抗體組合的技術(shù)性考慮：基于血液腫瘤的復(fù)雜性，提供一個(gè)通用的抗體選擇策略是不現(xiàn)實(shí)的。國(guó)際上迄今也沒(méi)有一致性的抗體組合。應(yīng)該意識(shí)到，沒(méi)有一個(gè)神奇的既小又功能齊全的抗體組合可以解決所有的臨床相關(guān)答案。一個(gè)局限性的小組合也可能影響對(duì)樣本的正確評(píng)估和分類(lèi)。確認(rèn)細(xì)胞異常的能力與所用抗體的數(shù)量直接成正比。
    （1）選擇抗體組合的基本原則如下：
    1）所選的抗體組合應(yīng)足夠?qū)?，可以鑒別樣本中的所有細(xì)胞亞群包括正常和異常群體。抗體的數(shù)量越多，檢測(cè)的靈敏度越高。應(yīng)該指出，由于腫瘤細(xì)胞常常缺少細(xì)胞的正常標(biāo)記或表達(dá)異常，所以特異性抗體一定程度上的重復(fù)選擇有時(shí)是必要的。
    2）抗體的選擇應(yīng)可以區(qū)分正常和異常細(xì)胞，正常細(xì)胞可作為實(shí)驗(yàn)的內(nèi)參照，異常細(xì)胞的表達(dá)比例也更準(zhǔn)確。如現(xiàn)在用CD45抗體來(lái)區(qū)分正常和幼稚細(xì)胞，此方法尤其在幼稚細(xì)胞含量少時(shí)更顯優(yōu)勢(shì)。
    3）熒光強(qiáng)度和表位密度應(yīng)同時(shí)考慮。對(duì)表達(dá)少的抗原表位應(yīng)盡可能選擇強(qiáng)度強(qiáng)的熒光素。
    4）必要時(shí)用活性檢測(cè)排除死細(xì)胞較強(qiáng)的非特異性染色。國(guó)外統(tǒng)計(jì)，約70%組織樣本和48%血或骨髓標(biāo)本有活性檢測(cè)結(jié)果。
    5）實(shí)驗(yàn)人員應(yīng)了解所用抗體的反應(yīng)細(xì)胞譜，以及與特定熒光素結(jié)合后的染色模式。相同的CD編號(hào)的不同抗體可能有不同的結(jié)合模式。
    （2）常用的方案考慮：大而全的抗體組合：全面了解抗原表達(dá)，無(wú)需額外染色，省時(shí)但 費(fèi)用高。先用篩查試劑了解樣本的一般情況，再根據(jù)所得信息采用第二線(xiàn)特異性更高的抗體組。經(jīng)濟(jì)，但費(fèi)時(shí)，也需要正確的抗體選擇的策略性決定。但考慮到所用時(shí)間和設(shè)備費(fèi)用，只有約30%國(guó)外實(shí)驗(yàn)室采用此法。基于臨床或形態(tài)學(xué)的資料，選用有目標(biāo)性的抗體組合以確認(rèn)可疑的診斷或分類(lèi)。

    4.樣本獲取
    通常，每個(gè)標(biāo)本應(yīng)獲取1-2x104個(gè)有核細(xì)胞的熒光和散射光信號(hào)，微小殘余病變分析則需5x104個(gè)細(xì)胞。惡性細(xì)胞常有較寬的大小和粒度范圍，獲取時(shí)最好收集無(wú)門(mén)的數(shù)據(jù)以保留所有未知異常細(xì)胞群體的所有特性。免疫熒光信號(hào)要求對(duì)數(shù)放大和至少256道的分辨率。無(wú)論選擇對(duì)數(shù)或線(xiàn)性放大都要以保證異常細(xì)胞都能被檢測(cè)到。

    5.數(shù)據(jù)分析
    只有通過(guò)多參數(shù)分析，才能最大程度地區(qū)分異質(zhì)的樣本中的正常和異常細(xì)胞。多參數(shù)分析意味著綜合細(xì)胞的光散射和多色熒光特征。最少的要求應(yīng)是4個(gè)參數(shù)（2個(gè)光散射和2個(gè)熒光參數(shù)）。采用的參數(shù)越多，分析步驟越復(fù)雜，流式免疫分型的靈敏度越高。
    （1）分析技術(shù)：數(shù)據(jù)的分析方式隨樣本的特性、抗體組合及臨床情況的不同而變化。但總的原則是要用多參數(shù)的數(shù)據(jù)創(chuàng)造可以區(qū)分正常和異常細(xì)胞的圖形，如FSC vs. SSC, FL vs. FL, Scatter vs.FL等，散射光與熒光參數(shù)的綜合分析常常能提供有效的信息。
    （2）分析步驟：首先分析所有細(xì)胞的抗原表達(dá)情況，鑒別出正常細(xì)胞和異常細(xì)胞群體，正常細(xì)胞的表現(xiàn)可以作為整個(gè)實(shí)驗(yàn)染色過(guò)程的內(nèi)部參照，提供實(shí)驗(yàn)一致性與否的客觀證據(jù)，異常細(xì)胞則通過(guò)進(jìn)一步設(shè)門(mén)分析確定表型特點(diǎn)。
    （3）設(shè)門(mén)：即選擇特殊的細(xì)胞群體分析其各個(gè)參數(shù)的表現(xiàn)，是一個(gè)基本的分析技巧。把分析局限在門(mén)內(nèi)的細(xì)胞群體的前提是門(mén)內(nèi)的細(xì)胞代表所有感興趣的細(xì)胞，而且沒(méi)有其他細(xì)胞的污染。一般來(lái)說(shuō)，不同疾病的設(shè)門(mén)策略亦不同，常用的FSC vs. SSC的設(shè)門(mén)方式可能不總是適用于L&L分析，如在急性白血病中，CD45和SSC的雙參數(shù)顯示是鑒別幼稚細(xì)胞的一個(gè)簡(jiǎn)單而有效的方法；在B細(xì)胞淋巴瘤中用一個(gè)全B細(xì)胞的抗體設(shè)門(mén)來(lái)看抗κ鏈和抗λ鏈的表現(xiàn)；T細(xì)胞淋巴瘤時(shí)用一個(gè)全T細(xì)胞抗體設(shè)門(mén)使腫瘤細(xì)胞的分型更加明確。另外，通過(guò)細(xì)胞特異的抗原表達(dá)確定其光散射區(qū)域的”backgate“的方法也很實(shí)用，如通過(guò)CD14vs.CD45的雙參數(shù)分析區(qū)分多個(gè)區(qū)域的淋巴、單核和粒細(xì)胞群體。
    （4）分析異常細(xì)胞群體：確定異常細(xì)胞群體后要進(jìn)一步分析其免疫分型。分析抗原表達(dá)要注意：
    ①在 L&L中，定性的描述（陽(yáng)性或陰性）通常要比陽(yáng)性百分率的計(jì)算更有價(jià)值。只有在設(shè)門(mén)內(nèi)細(xì)胞全部是感興趣的細(xì)胞而且熒光分布的形狀可以非常清楚地區(qū)分陽(yáng)性和陰性亞群的情況下，陽(yáng)性百分率才有意義。當(dāng)然，在某些抗原異質(zhì)表達(dá)的群體中，可進(jìn)行定性或定量的分析（X% 幼稚細(xì)胞CDX陽(yáng)性）；百分率也可用于描述異常和正常細(xì)胞的比例。
    ②評(píng)估抗原表達(dá)強(qiáng)度是分析的重要組成部分。對(duì)于一個(gè)特異的抗體而言，熒光強(qiáng)度是抗原密度的反應(yīng)，同時(shí)也與所用的熒光素和獨(dú)特的熒光素抗體復(fù)合物有關(guān)。有時(shí)確認(rèn)異常群體是因?yàn)闆](méi)有表達(dá)應(yīng)該表達(dá)的抗原，但有時(shí)只能從抗原表達(dá)的異常強(qiáng)度來(lái)判斷。如用一些髓性抗原CD14，CD33，CDw65的相對(duì)表達(dá)強(qiáng)度和散射光特征一起來(lái)確認(rèn)單核細(xì)胞系和粒細(xì)胞系的發(fā)展成熟過(guò)程。熒光強(qiáng)度的評(píng)估在大多數(shù)情況下可以采用定性的資料，但由于試劑和機(jī)器上的不同，僅僅基于熒光道數(shù)的簡(jiǎn)單標(biāo)準(zhǔn)可能并不足夠，最好以其在相同條件下相對(duì)正常細(xì)胞的強(qiáng)度來(lái)表示。如CD45，CD8或CD38等在不同細(xì)胞上的表達(dá)密度相差幾個(gè)對(duì)數(shù)范圍，CD22或CD4等抗原則在所謂陽(yáng)性范圍內(nèi)在不同細(xì)胞類(lèi)型上的區(qū)別較小。
    ③區(qū)分弱陽(yáng)性和陰性群體：在某些情況下對(duì)診斷有較大的價(jià)值，如B細(xì)胞惡性腫瘤的CD5弱表達(dá)，但弱表達(dá)的判斷卻常常很難?，F(xiàn)行的標(biāo)準(zhǔn)如”20%陽(yáng)性“等都仍是人為的標(biāo)準(zhǔn)。依照直方圖上與對(duì)照組相比向右移動(dòng)來(lái)判斷陽(yáng)性所需的最小位移也是人為的標(biāo)準(zhǔn)。可用K-S統(tǒng)計(jì)來(lái)比較直方圖的區(qū)別。亦可選用強(qiáng)的熒光染料，或用過(guò)量未標(biāo)的抗體阻斷非特異染色，從而判斷弱陽(yáng)性染色的特異與否。

    6. 數(shù)據(jù)解釋
    雖然對(duì)流式免疫分型結(jié)果的解釋最好與形態(tài)學(xué)結(jié)果綜合考慮，但流式的作用仍遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于對(duì)形態(tài)學(xué)結(jié)果的簡(jiǎn)單證實(shí)。流式可能幫助形態(tài)學(xué)確認(rèn)某些診斷，也可能提出之前沒(méi)有考慮的診斷，甚至在一些典型表現(xiàn)下流式免疫分型可以在其他方法的輔助下診斷疾病，但應(yīng)盡量解釋任何流式結(jié)果和其他方法結(jié)果上的不一致，流式結(jié)果應(yīng)與臨床、形態(tài)學(xué)、細(xì)胞遺傳等其他方法綜合考慮。