慢性乙肝口服藥抗病毒治療已有10余年的歷史，各種核苷（酸）類似物隨著臨床應(yīng)用經(jīng)驗的日益積累，目前已經(jīng)邁向通過優(yōu)化治療提高療效、管理耐藥的時代。各種核苷（酸）類似物都在努力尋找適合自身特點的優(yōu)化方法，不僅把耐藥風(fēng)險降至最低，同時最大限度地提高療效，從而真正使患者達(dá)到慢性乙肝治療近期目標(biāo)，即持久抑制乙肝病毒（HBV）DNA復(fù)制和實現(xiàn)乙肝病毒e抗原（HBeAg）血清學(xué)轉(zhuǎn)換。

    一、核苷(酸)類似物耐藥現(xiàn)狀

    目前我國用于治療|的核苷(酸)類似物(NAs)主要有4種：拉米夫定(LAM)、阿德福韋酯(ADV)、替比夫定(LdT)和恩替卡韋(ETV)。在歐美及亞洲的一些國家和地區(qū)，還有替諾福韋酯(TDF)等。LAM治療1年時的耐藥率為24%，治療5年時的耐藥率高達(dá)70%。LdT治療2年時，HBeAg陽性和陰性慢性乙型肝炎患者的耐藥率分別為25%和11%；治療5年時，HBeAg陽性和陰性慢性乙型肝炎患者的累積耐藥率分別為42%和29%。我國報告，ADV治療HBeAg陽性慢性乙型肝炎患者5年累積耐藥率為14.6%。ETV治療5年時的耐藥率為1.2%(但在隨訪隊列中排除了少數(shù)無應(yīng)答者；治療3年后ETV用1mg劑量；系基于108例患者的資料)。TDF單藥治療至240周時仍未檢測到相關(guān)的耐藥變異。

    二、核苷(酸)類似物耐藥機(jī)制及影響因素

    (一)耐藥機(jī)制
    病毒耐藥的發(fā)生反應(yīng)病毒為逃逸藥物壓力而發(fā)生的一系列適應(yīng)性突變，最終導(dǎo)致病毒對藥物的敏感性下降。在患者體內(nèi)HBV的復(fù)制效率很高，每天可產(chǎn)生1012~1013個病毒顆粒，較丙型肝炎病毒(HCV)和人類免疫缺陷病毒(HIV)分別高10和100倍，HBV聚合酶是一種逆轉(zhuǎn)錄酶，缺乏校正能力，其錯配率較高，每復(fù)制105個堿基對即可產(chǎn)生一個突變。依此推算，患者體內(nèi)的HBV每天可發(fā)生1010~1011位點突變。HBV的基因組全長為3.2kb，如此高的突變率，HBV全基因組的每個位點均可能發(fā)生突變。HBV復(fù)制的這一特點也決定在同一患者體內(nèi)的病毒構(gòu)成并不均一，而是由基因序列存在差異的多種病毒株組成，這些序列不同的病毒群構(gòu)成了準(zhǔn)種(quasispecies)。目前抗病毒治療的NAs作用靶點均為病毒聚合酶基因，已知與耐藥相關(guān)的突變均位于HBV聚合酶基因的逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)(RT區(qū))，可分為原發(fā)耐藥突變和繼發(fā)耐藥突變。

    (二)耐藥的影響因素
    1.病毒因素：包括病毒的復(fù)制速度、復(fù)制的保真性、基線的HBVDNA載量、準(zhǔn)種、預(yù)存耐藥突變、耐藥突變株的適應(yīng)性和復(fù)制空間等。
    2.宿主因素:包括既往抗病毒治療史、依從性、機(jī)體免疫和代謝狀況、藥物遺傳學(xué)和宿主的體重等。
    3.藥物方面：包括藥物的耐藥基因屏障、抗病毒效力、劑量、化學(xué)結(jié)構(gòu)等。

    三、耐藥突變與S基因突變

    由于在HBV基因組中，病毒聚合酶編碼基因與包膜蛋白編碼基因(S)的開放讀碼框(ORF)存在重疊，S基因完全被聚合酶基因覆蓋，NAs治療誘導(dǎo)的聚合酶編碼基因的耐藥突變可能使編碼HBV表面抗原(HBsAg)的S基因發(fā)生突變，從而導(dǎo)致HBsAg抗原性、結(jié)構(gòu)或適應(yīng)性發(fā)生變化，產(chǎn)生免疫逃逸突變株等。有研究報道，rtA181T/sW172*突變毒株具有潛在致癌性，可能加速HCC的發(fā)展。但多數(shù)為體外細(xì)胞和動物試驗研究，尚需進(jìn)一步開展前瞻性臨床研究證實。

    四、耐藥模式(通路)
    目前主要的耐藥模式(通路)有以下5種：
    (一)左旋核苷模式(通路)
    rt204位點突變。rtM204V/I可引起左旋核苷類藥物(如LAM和LdT)耐藥，進(jìn)一步促進(jìn)環(huán)戊烷(烯)類藥物(ETV)耐藥。
    (二)無環(huán)磷酸鹽模式(通路)
    rt236位點突變。rtN236T可導(dǎo)致無環(huán)磷酸鹽化合物ADV耐藥，并降低TDF的敏感性。
    (三)共享(公共)模式(通路)
    rt181位點突變可導(dǎo)致左旋核苷類藥物和ADV耐藥，并降低TDF的敏感性；這一模式可見于40%ADV治療失敗和5%LAM治療失敗患者。
    (四)雙重模式(通路)
    rtA181T/V加rtN236T位點突變顯著降低TDF的抗病毒活性[22，35]，導(dǎo)致持續(xù)的病毒血癥[21]。
    (五)ETV初治模式
    rtL180M加rtM204V/I再加上rtI169、rtT184、rtS202或rtM250任意一個或多個位點突變；3個突變同時發(fā)生可導(dǎo)致ETV耐藥。

    五、多藥耐藥
    在因耐藥挽救治療或因其他原因應(yīng)用多種NAs治療的患者體內(nèi)，可能發(fā)生針對多種NAs的耐藥突變，特別是用有交叉耐藥的藥物序貫治療時更易發(fā)生。研究還發(fā)現(xiàn)，即便采用“加藥”策略，如果不能迅速抑制病毒，也可能選擇出多藥耐藥突變。不同的耐藥突變共存于同一病毒株，使該毒株對多種NAs耐藥。

    六、抗病毒治療應(yīng)答
    慢性乙型肝炎抗病毒治療可表現(xiàn)為原發(fā)無應(yīng)答、部分病毒學(xué)應(yīng)答、完全病毒學(xué)應(yīng)答、生化學(xué)應(yīng)答、病毒學(xué)突破、生化學(xué)突破、病毒學(xué)反彈和肝炎發(fā)作。病毒學(xué)突破是耐藥最早的臨床表現(xiàn)。發(fā)生病毒學(xué)突破后，90%以上的患者可出現(xiàn)生化學(xué)突破。如不挽救治療，可發(fā)生肝炎發(fā)作，也可能出現(xiàn)肝臟功能失代償、急性肝衰竭，甚至死亡。

    七、耐藥的評估
    (一)HBVDNA監(jiān)測和隨訪
    血清HBVDNA載量是對病毒復(fù)制水平的直接反應(yīng)，HBVDNA監(jiān)測對評估治療成敗至關(guān)重要。無論是在基線評估，還是治療應(yīng)答評估，抑或是病毒學(xué)突破判斷上，均應(yīng)使用靈敏、特異、線性范圍廣的實時定量PCR方法檢測HBVDNA水平。為確保檢測結(jié)果的穩(wěn)定性和一致性，對于在同一個地方就診的同一例患者，應(yīng)堅持采取同一種檢測方法進(jìn)行評估。
    開始NAs治療前，應(yīng)對患者進(jìn)行基線HBVDNA定量檢測，判斷治療適應(yīng)癥和預(yù)測療效。治療期間，應(yīng)至少每3個月檢測1次HBVDNA；獲得完全病毒學(xué)應(yīng)答后，可每3~6個月檢測一次。用高耐藥基因屏障藥物，如ETV或TDF治療時，如果能確?；颊叩囊缽男粤己茫部煽紤]減少檢測次數(shù)(延長監(jiān)測間隔)。
    (二)耐藥基因檢測
    目前國內(nèi)尚缺乏規(guī)范、標(biāo)準(zhǔn)、統(tǒng)一的耐藥基因的檢測方法，不同的引物、不同的測序公司、不同的試劑盒的檢測結(jié)果可能不同。因此，耐藥基因檢測必須標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)范化，并用統(tǒng)一方法檢測，根據(jù)患者的用藥情況進(jìn)行針對性的耐藥基因檢測。

    常用的耐藥基因檢測方法有：
    1.PCR直接測序法：是最常用的基因耐藥檢測方法之一，能測出所有變異位點，包括可能的補償性突變和新突變位點，對于新的治療手段，或現(xiàn)行治療的新耐藥相關(guān)位點突變，需用體外表型分析法驗證。直接PCR測序法的靈敏度低，最低檢測限為20%，即突變株數(shù)量需達(dá)到整個病毒群的20%時，才能檢測到。
    2.克隆測序法：是將PCR產(chǎn)物連接載體后轉(zhuǎn)化至細(xì)菌，跳去10~30個陽性克隆進(jìn)行測序，有助于發(fā)現(xiàn)混合株，并可大致確定不同序列毒株之間的相對比例，其靈敏度高于PCR直接測序法，但操作相對較復(fù)雜，費用較高。
    3.限制性片段長度多態(tài)性技術(shù)（RFLP）靈敏，最低檢測限為5%，但必須針對每一個待測突變位點，分別設(shè)計特異性內(nèi)切酶反應(yīng)系列，僅適用于已知的耐藥位點。
    4.線性探針反向雜交法（INNO-LiPA）靈敏，最低檢測限為5%，可檢測單個核苷酸錯配，僅適用于已知的耐藥位點。
    5.此外，還有基因芯片技術(shù)、限制性片段質(zhì)譜多態(tài)性分析、焦磷酸測序法、深度測序法等。

    八、耐藥管理
    1.LAM和LdT耐藥加用ADV，有條件者可換用或加用TDF。
    2.ADV耐藥加用或換用LAM、LdT或ETV，首選ETV；有條件者可將ADV換成TDF加另一種無交叉耐藥的NA治療。如果在用ADV治療前，患者未曾使用過LAM或LdT，亦可換用ETV，或換用TDF或TDF-恩曲他濱合劑。由于ADV與TDF存在一定程度的交叉耐藥，對于ADV耐藥且病毒載量較高的患者，TDF單藥治療的療效欠佳，可首選ETV。如曾使用過LAM、LdT，可換TDF治療。
    3.ETV耐藥可加用ADV；有條件者可換用或加用TDF。
    4.TDF耐藥建議進(jìn)行基因耐藥分析和表型耐藥分析，確定交叉耐藥譜。對證實發(fā)生TDF耐藥者，推薦加無交叉耐藥的NA；如果患者既往無LAM耐藥，也可換用ETV。如無上述檢測條件，亦可考慮加用ETV治療。
    5.多藥耐藥對于用LAM或LdT和ADV治療失敗的患者，懷疑多藥耐藥時，應(yīng)進(jìn)行耐藥基因檢測。對多藥耐藥患者，應(yīng)聯(lián)合使用核苷類似物和核苷酸類似物治療，優(yōu)先選擇ETV聯(lián)合TDF。但TDF目前在我國尚未上市，若出現(xiàn)多藥耐藥，處理將十分棘手。因此，多藥耐藥管理的關(guān)鍵在于預(yù)防，需反復(fù)強(qiáng)調(diào)初治藥物選擇和最大限度地抑制病毒復(fù)制的重要性，避免低耐藥基因屏障NA單藥序貫治療，盡量減少或避免多藥耐藥的發(fā)生。

    九、耐藥的預(yù)防
    1.仔細(xì)了解患者既往治療史。
    2.初始選用強(qiáng)效、低耐藥藥物單藥長期治療。
    3.加強(qiáng)患者對疾病的認(rèn)識和依從性教育。
    4.避免單藥序貫治療。
    5.嚴(yán)格掌握治療適應(yīng)癥。
    6.加強(qiáng)對醫(yī)務(wù)人員和患者抗病毒治療耐藥預(yù)防和管理的教育。

    優(yōu)化治療策略，提高療效和降低耐藥
    相對于目前的各種核苷（酸）類似物，替比夫定的臨床研究數(shù)據(jù)提供了相對完整的基線優(yōu)化和24周早期應(yīng)答優(yōu)化數(shù)據(jù)，使臨床醫(yī)生可通過患者基線情況和早期應(yīng)答情況及時調(diào)整治療方案，以獲得更好的長期療效，降低耐藥。
    基線優(yōu)化GLOBE研究亞組分析顯示，替比夫定治療基線丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）≥2×正常值上限（ULN）且HBVDNA＜9log10拷貝/ml的HBeAg陽性患者，104周時的HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換率為47%，HBVDNA檢測不到率（＜300拷貝/ml）為77%，耐藥率為11%；替比夫定治療基線HBVDNA＜7log10拷貝/ml的HBeAg陰性患者，104周時的HBVDNA檢測不到率達(dá)89%，耐藥率僅3%。
    基線結(jié)合24周早期應(yīng)答可進(jìn)一步提高療效替比夫定GLOBE研究亞組分析顯示，替比夫定治療基線ALT≥2×ULN和HBVDNA＜9log10拷貝/ml的HBeAg陽性患者，24周時71%的患者HBVDNA檢測不到（<300拷貝/ml）；繼續(xù)治療到104周，HBVDNA檢測不到率達(dá)89%，HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換率為52%，而耐藥率僅為1.8%。替比夫定治療基線HBVDNA＜7log10拷貝/ml的HBeAg陰性患者，24周時95%的患者HBVDNA檢測不到（＜300拷貝/ml），繼續(xù)治療到104周，HBVDNA持續(xù)檢測不到率達(dá)91%，ALT復(fù)常率為83%，耐藥率僅為2%。
 

    替比夫定與阿德福韋酯聯(lián)合治療YMDD耐藥變異患者的療效顯著
    目前對YMDD耐藥變異的處理，國內(nèi)外指南均建議采用兩種無交叉耐藥的藥物進(jìn)行聯(lián)合治療。2011年亞太肝臟研究學(xué)會（APASL）年會上，第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院王宇明教授報告了一項研究，探討了拉米夫定或替比夫定單藥治療2~4年后發(fā)生YMDD變異的患者，接受替比夫定聯(lián)合阿德福韋酯治療1年的療效和安全性。結(jié)果顯示，對于出現(xiàn)YMDD變異的患者，采用替比夫定聯(lián)合阿德福韋酯治療，12、24和52周時HBVDNA水平較基線顯著下降，下降值分別為4.39、5.07和5.36log10拷貝/ml（P＜0.001）；52周時，52.6%的患者HBVDNA檢測不到（＜300拷貝/ml），72.4%的患者ALT復(fù)常，23.7%的患者HBeAg轉(zhuǎn)陰，15.8%的患者出現(xiàn)HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換，獲得了顯著療效。
    綜上所述，優(yōu)化治療策略是慢性乙肝治療的重要策略，不僅可降低核苷（酸）類似物的耐藥風(fēng)險，同時可能進(jìn)一步提高療效，使更多患者達(dá)到“雙達(dá)標(biāo)”，即強(qiáng)病毒抑制和高HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換率，從而降低肝癌和肝硬化的發(fā)生。
    控制病毒是治療乙肝的根本，然而病毒耐藥卻是實現(xiàn)乙肝治療目標(biāo)的一個“路障”。堅持“雙優(yōu)”，即優(yōu)選藥物和優(yōu)化治療，實現(xiàn)強(qiáng)效降低病毒量，有利于降低耐藥風(fēng)險。
    當(dāng)前尚無法徹底清除乙肝病毒，因此治療乙肝的目標(biāo)是長期地控制病毒不復(fù)制，這樣才能有效延緩疾病進(jìn)展，從而預(yù)防肝硬化和肝癌的發(fā)生。然而現(xiàn)實中很多患者接受抗病毒治療出現(xiàn)耐藥，影響治療效果。因此，剛開始接受治療的患者必須優(yōu)選藥物，以減少耐藥機(jī)會。